【MTT实验原理、步骤、注意事项】MTT实验，全称为3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐实验，是一种广泛应用于细胞生物学和药物筛选中的体外细胞活性检测方法。该实验通过测定细胞的代谢活性来评估细胞的存活率，是研究细胞增殖、毒性反应及药物作用机制的重要工具。

一、MTT实验的基本原理

MTT实验的核心在于利用线粒体脱氢酶对MTT的还原作用。活细胞内的线粒体中含有一种叫做琥珀酸脱氢酶的酶类，这种酶能够将淡黄色的MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）还原为不溶于水的紫色结晶——甲臜（Formazan）。这些结晶沉积在细胞内或细胞周围，其生成量与细胞的活性成正比。

因此，通过溶解甲臜并使用分光光度计测量特定波长下的吸光度（通常为570 nm），可以间接反映细胞的存活数量和活性水平。

二、MTT实验的操作步骤

1. 细胞培养与处理

将目标细胞接种于96孔板中，根据实验需求加入不同浓度的药物或其他处理因素，设置对照组和实验组。

2. 加入MTT溶液

在细胞培养结束后，向每孔中加入适量的MTT溶液（通常为5 mg/mL），孵育一定时间（一般为4小时左右）。

3. 去除培养液并溶解甲臜

弃去培养液后，加入一定量的DMSO或其他溶解液，充分振荡使甲臜完全溶解。

4. 测定吸光度

使用酶标仪在570 nm波长下测定各孔的吸光度值，记录数据。

5. 数据分析

根据吸光度值计算细胞存活率，绘制剂量-效应曲线，分析药物对细胞的影响。

三、MTT实验的注意事项

1. 细胞密度控制

实验前需确保细胞处于对数生长期，并严格控制接种密度，避免因细胞过密或过疏影响实验结果。

2. MTT溶液的配制与保存

MTT溶液应现用现配，避免长时间放置导致降解；储存时应避光、低温保存。

3. 孵育时间的控制

孵育时间过短可能导致甲臜生成不足，时间过长则可能引起细胞死亡或甲臜过度沉积，影响结果准确性。

4. 溶解液的选择

常用的溶解液包括DMSO、异丙醇等，需确保其纯度，避免杂质干扰吸光度测定。

5. 重复性与对照设置

每个实验组应设置至少三个重复孔，同时设立空白对照组和阴性/阳性对照组，以提高实验的可信度和可重复性。

6. 仪器校准与操作规范

使用分光光度计前需进行校准，确保读数准确；操作过程中注意避免污染和交叉感染。

四、总结

MTT实验作为一种简便、灵敏且成本较低的细胞活性检测方法，在生物医学研究中具有广泛应用价值。然而，为了保证实验结果的准确性和可靠性，研究者需严格按照标准操作流程进行实验，并关注各项关键细节。只有在严谨的实验设计和规范的操作下，才能获得真实、有效的数据，为后续研究提供可靠依据。